本申请提供一种快速评价棉花对草甘膦耐受性的方法，所述方法包括：播种待测棉花种子；棉花子叶期，分别用浓度为0g a.i./L、1.37ga.i./L～2.05g a.i./L、2.73g a.i./L～4.10g a.i./L和8.20g a.i./L的草甘膦进行喷施，其中草甘膦浓度0g a.i./L为对照组，其余浓度为试验组；喷施3～5天后，测量棉花子叶中的莽草酸含量；通过比较试验组的棉花子叶中的莽草酸含量和对照组的棉花子叶中的莽草酸含量在统计学上是否具有显著差异来判断棉花对草甘膦的耐受性。所述方法耗时短、占用空间小、成本低、准确性高且重复性好，特别适合多材料、大批量的测定，易于在农业领域中推广应用。